Besamungstechnik

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    Re: Besamungstechnik

    Saphir85 - 07.04.2006, 10:01

    Besamungstechnik
    Hallo Ihrl lieben

    Hier findet Ihr alles wichtige über die Besamungstechnik, da es den "Natursprung" Ja kaum noch gibt!!!



    Unaufhaltsam zieht der wissenschaftliche Fortschritt in die Besamungsstationen der europäischen Pferdezucht ein: Was in Bezug auf Besamung und sogar Embryotransfer noch vor etwa 10 Jahren reine Zukunftsvision war, ist heute teilweise bereits bewährte Praxis. In diesem Zusammenhang soll hier schwerpunktmäßig auf die Bedeutung und die praktischen, zukunftsorientierten Einsatzmöglichkeiten besonders der Tiefgefriertechniken zur Konservierung von Pferdesamen und -embryonen eingegangen werden.

    Keimzellen wie Samen- und Eizellen oder wenige Tage alte Embryonen, der Ursprung allen Pferdelebens, aus dem Entwicklungsprozeß herauszunehmen und bei -196 Grad C tiefzugefrieren und dann nach Tagen, Monaten oder Jahren des "Dornröschenschlafes" wieder zurückzubringen in ihre natürliche Umgebung, so dass sie sich zu normalen Lebeweise weiterentwickeln können, das ist schon an und für sich "märchenhaft" faszinierend. Aber wozu so etwas Umständliches beginnen, wenn es doch zugegebenermaßen auch einfacher geht? Pferde können sich doch schließlich auch von selbst fortpflanzen!

    Bedeutung und Zweck der Besamung
    Der wesentliche Unterschied zwischen der natürlichen Vermehrung (nicht zu verwechseln mit dem sogenannten Natursprung) und der von Menschen betriebenen Pferdezucht besteht jedoch der Hauptsache nach darin, dass im ersteren Falle die Natur, im letzteren Falle der Mensch die Zuchtwahl trifft. Während in einer natürlichen Herde sich der stärkste und vitalste Hengst durchsetzt und diese beschützt und sie über Jahre hinweg als stabile, hygienisch abgeschlossenen Population bewahrt, paart der Mensch nach seinen eigenen Maßstäben die Hengste und Stuten aus vielen, sehr verschiedenen Verhältnissen miteinander an, um die Möglichkeiten der Zuchtwahl auszunutzen. Züchten heißt nämlich in ersten Linie auswählen, gezielt kombinieren und wieder auswählen, Bewährtes erhalten, Erwünschtes zuführen und Unerwünschtes verdrängen. Entscheidend ist hierbei die Auswahl unter einer hinreichend großen Variationsbreite von Zuchtqualitäten.

    Für den einzelnen Züchter heißt dies konkret: Je größer das Angebot von Hengsten zur Belegung seiner Stuten, desto größer der mögliche Zuchtfortschritt. Denn die Wahrscheinlichkeit, den optimalen Partner zu finden, steigt mit dem Angebot qualitätsvoller Vererber. Andererseits steigt mit dem Transport von Stuten oder Samen über weite Entfernungen - von Herde zu Herde sozusagen - auch das Infektionsrisiko. Hieraus ergeben sich im wesentlichen drei Maßgaben für die moderne Pferdezuchtechnologie: Erstens muß sie dem Züchter eine größtmögliche Zuchtwahl verschaffen. Zweitens muß sie vor hygienischen Risiken schützen. (In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass die künstliche Besamung in der Rinderzucht in den fünfziger Jahren in Deutschland ausschließlich auf Grund seuchenhygienischer Sachverhalte eingeführt wurde!) Und drittens müssen die Stuten tragend werden, denn die Züchter wollen lebende Fohlen sehen.

    Die Möglichkeiten der vergrößerten Zuchtwahl sind bereits in den letzten Jahren durch den Versand von Frischsamen von den Züchtern in zunehmendem Maße in Anspruch genommen worden. Die Nachfragen nach Tiefgefriersamen ist jedoch nach wie vor gering geblieben. Kaum ein Züchter traut nach persönlichen Erfahrungen diesem "Zeug" so richtig über den Weg. Da bei uns in Deutschland nach wie vor wesentlich mehr mit Frisch- als mit TG-Samen gearbeitet wird, liegen auch bei Züchtern sowie Tierärzten nur wenige Erfahrungen mit TG-Samen vor. Hengste, die z.T. ausschließlich über TG-Samen zur Verfügung stehen, werden daher kaum genutzt. Ihr züchterischer Einfluß kann als unbedeutend bezeichnet werden. Und die ausschließlich wegen psychologischer Vorbehalte bzw. Vorurteile! In Frankreich, wo wesentlich mehr mit Gefriersamen und weniger mit Frischsamen gearbeitet wird, bestehen diese Vorurteile nicht.

    Vergleich Frisch- gegen TG-Samen
    Nun, worin bestehen die Vor- und Nachteile von TG-Samen im Vergleich zu Frischsamen? Ein wesentlicher Nachteil des TG-Samens besteht nach wie vor darin, dass er nach Versamung nicht solange befruchtungsfähig bleibt wie Frischsamen. Das bedeutet, die Besamung mit TG-Samen muß möglichst genau um den Eisprung herum erfolgen, nämlich frühestens 24 Stunden vorher und höchstens 6 Stunden danach. Auf professionellen Besamungsstationen, auf denen zur Erzielung optimaler Befruchtungsergebnisse auch für die Frischbesamung sehr präzise gearbeitet wird, stellt dies keine besondere Herausforderung dar. Der Vorteil von TG-Samen besteht in der Regel darin, dass die Qualität ziemlich konstant ist, man sich also hierauf einstellen kann, und dass der Samen, einmal geliefert, fortan zum Besamungszeitpunkt zur Verfügung steht, ohne zu verderben. Man ist aus organisatorischen Gründen nicht derart abhängig von der exakten Zustellung und der " Einhaltung der Kühlkette", wie dies beim Frischsamen der Fall ist.
    Der entscheidende Vorteil des TG-Samens nämlich ist seine prinzipielle Unverderblichkeit, was seinen Transport über Kontinente und Ozeane hinweg ermöglicht und ebenso die sparsame Verwendung des Samens, wenn der Spender zum Besamungszeitpunkt wegen Sporteinsatzes oder Krankheit oder sonstiger Gründe nicht verfügbar ist. Und schließlich bleibt noch die Möglichkeit, Hengste auch nach ihrem oft viel zu frühen Tod noch segensreich für die Gesamtzucht einsetzen zu können.

    Embryotransfer
    Seit etwa 1980 bemühen sich einige Wissenschaftler und Tierärzte um die erfolgreiche Einführung des Embryotransfers in die Pferdezucht. Trotz vereinzelter Erfolge in verschiedenen Ländern wie den USA, Frankreich, England, Holland und auch Deutschland, haben zahlreiche Gruppen ihre Arbeit auf diesem Gebiet wegen insgesamt zu geringer Effektivität stark eingeschränkt oder aber eingestellt. Nicht ohne Stolz können wir in Hasbergen behaupten, durch die erfolgreiche Einführung einer besonderen Tiergefriertechnik in unsere ET-Programme ein Konzept entwickelt zu haben, das eine breitere, wirtschaftliche Anwendung des Embryotransfers in der Pferdezucht ermöglicht.

    Die Samenzubereitung
    Die Samengewinnung vom Hengst erfolgt - wie den meisten Züchtern inzwischen geläufig - meist am Phantom oder einer rossigen Stute. Nach dem Aufsprung wird das Ejakulat mit einer künstlichen Scheide aufgefangen. Dieses Ejakulat enthält Milliarden von Samenzellen, die sich in dem sogenannten Seminalplasma (der Samenflüssigkeit) befinden. Dieses Plasma ist an der Luft spermienfeindlich! Damit der Samen sich möglichst lange befruchtungsfähig hält, müssen die Samenzellen daher "gewaschen" werden. Dies erfolgt durch Zugabe von Samenverdünner und anschließender Zentrifugation. So aufbreitet, kann der Samen auf 4 Grad - 7 Grad C gekühlt werden und hält sich je nach Hengst und Verdünnungsverfahren 24 Stunden bis zu sechs Tagen befruchtungsfähig.
    Bei der Zubereitung des Gefriersamens wird dem Verdünner nach dem "ersten Waschgang" ein Gefrierschutzmittel zugegeben. Dieses Gefrierschutzmittel ersetzt in den Zellen teilweise das Wasser und verhindert so weitgehend eine Eiskristallbildung in den Zellen und somit deren Platzen während des Einfriervorganges. In der Regel wird der Samen dann für 20 Minuten bei -60 Grad C (in Stickstoffdampf) eingefroren und dann direkt in flüssigen Stickstoff (-196 Grad C) eingelagert.

    Selbstverständlich stellt die Tiefgefrierkonservierung einen Eingriff in die Funktionen und die Struktur der Samenzellen dar, und ein mehr oder minder großer Anteil dieser Zellen überlebt den Vorgang nicht. Dieser Anteil ist von Hengst zu Hengst unterschiedlich. Es gibt zweifelsfrei Hengste, deren Samen sich nicht zur TG-Konservierung eignet (zumindest mit den herkömmlichen Methoden). Dies schließt jedoch nicht aus, dass es durchaus möglich ist, sehr erfolgreich mit Gefriersamen der meisten Hengste zu arbeiten.

    Wenn es nicht "klappt"
    Nach eigenen Erfahrungen können mit TG-Samen die gleichen Resultate wie mit Frischsamen oder im Natursprung erzielt werden. Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass bei Misserfolgen nicht sofort und ausschließlich die Samenqualität in Frage gestellt wird. Wird eine Stute besamt - noch dazu mit Gefriersamen - und sie nimmt nicht auf, liegt sofort die Vermutung nahe, dass die Gründe hierfür beim Samen liegen. Nach unseren Erfahrungen liegen sie tatsächlich nur zu etwa 20 % beim Samen. Mindestens 80 % der Sterilitätsursachen sind jedoch anderswo zu finden, man muss diese nur auch suchen! Es kann nicht genug betont werden , dass die Stutenbesamung in die Hände von Fachtierärzten gehört, die hierfür qualifiziert sind.
    Beweisend für die uneingeschränkte Einsatzfähigkeit von Gefriersamen unter qualifizierten Voraussetzungen soll erwähnt werden, dass wir bereits von drei verschiedenen französischen bzw. amerikanischen Hengsten nach nur jeweils einer TG-Besamung erfolgreich Embryonen gewonnen haben, zweimal sogar zwei Embryonen in jeweils einer Spülung!
    Die Züchter können heute im allgemeinen davon ausgehen, dass der angebotenen Frisch- und TG-Samen qualitativ sehr hochwertig ist. Alles andere ist heute auf dem umkämpften Samenmarkt gar nicht konkurrenzfähig. Alle, die in den letzten Jahren im Besamungsgeschäft tätig waren, wissen, dass sich nur Trächtigkeiten verkaufen lassen. Hengsthalter, die minderwertigen bzw. nicht befruchtungsfähigen Samen anbieten, können nicht damit rechnen, ins Geschäft zu kommen.

    Was ist Embryotransfer?
    Unter Embryotransfer (ET) versteht man die Übertragung eines frühen Embryos wenige Tage nach der Befruchtung von einer sogenannten Spenderstute in die Gebärmutter einer entsprechend aufnahmebereiten Empfängerstute. Diese Empfängerin trägt dann dieses "fremde" Fohlen aus, während die genetische Mutter weitere Embryonen liefert, selbst tragend werden, oder aber z.B. im Sport ihre Eigenleistung unter Beweis stellen kann.

    Bedeutung des Embryotransfers
    Auch hier ergibt sich natürlich die Frage nach dem Wozu. Die Antwort lautet im Prinzip genauso wie bei der Besamung: Um die Möglichkeiten der Zuchtwahl zu erhöhen. Bei fixen Kosten in der Pferdezucht, verursacht durch Errichtung und Unterhalt von Gebäuden, Pflege von Wiesen, Futter-, Personal- und sonstigen Nebenkosten kann der Erlös für die aufgezogenen Pferde im wesentlichen nur durch deren Qualitätssteigerung erhöht werden. Qualität ist hierbei erstens genetisch bedingt und zweitens durch den Ausbildungsstand der angebotenen Reitpferde. Durch gezielte Anpaarung erstklassiger Mutterstuten mit Spitzenvererbern lassen sich durch den Embryotransfer relativ mehr Eliten erzeugen als ohne die entsprechend intensivierte Zuchtwahl auf Seiten der Mütter.

    In diesem Zusammenhang könnte der Embryotransfer auch gezielt, von Seiten der Zuchtleitung verschiedener Zuchtverbände, zur Produktion von Hengstanwärtern, und damit zur Steigerung des Zuchtfortschrittes der Gesamtpopulation angeregt und auch unterstützt werden, wie dies beispielsweise heute bereits durch die Vergabe von Verbands- und Staatsprämien geschieht. Die ausgewählten Stuten könnten in derartigen Fällen auch gleichzeitig ihre Eigenleistung werbekräftig und eindrucksvoll im Sport (nicht nur in einer Stutenleistungsprüfung) unter Beweis stellen. In der internationalen Rinderzucht ist in den letzten zwanzig Jahren durch die Verbindung von Embryotransfer und gezielten Anpaarungsversuchen ein kaum vorstellbarer Zuchtfortschritt erzielt worden.

    Embryonengewinnung
    Der Vorgang der Embryonengewinnung erfolgt durch Gebärmutterspülung mit Hilfe eines speziellen Spülkatheters durch die Scheide und ist genauso schmerzfrei wie beispielsweise die Besamung. Er kann nach jeder Rosse wiederholt werden, so dass im Laufe eines Zuchtjahres mehrere Embryonen gewonnen werden können. Im Gegensatz zu den Verhältnissen beim Rind, kann die Anzahl der Embryonen pro Spülung nicht hormonell erhöht werden (beim Rind sind nach sogenannten Superovulationsbehandlungen schon bis zu 30 Embryonen in einer Spülung gewonnen worden!). So werden bei der Stute höchstens zwei Embryonen pro Spülung gewonnen, diese sind allerdings fast immer von ausgezeichneter Qualität. Nach unseren Erfahrungen können bei normal fruchtbaren Stuten in 60 % - 80 % der Spülungen 1-2 lebensfähige Embryonen gewonnen werden. Dies entspricht in etwa der natürlichen Befruchtungsrate. Technisch kann die Methode also als ausgereicht angesehen werden.

    Übertragung der Embryonen
    Die Übertragung der Embryonen kann grundsätzlich entweder chirurgisch oder aber nicht-chirurgisch durchgeführt werden. Bei der letzteren Methode wird der Embryo mit Hilfe eines langen Metallstabes durch die Scheide und Muttermund wie bei einer Besamung in die Gebärmutter verbracht. Der chirurgische Transfer wird am stehenden Tier unter örtlicher Betäubung in der Flanke druchgeführt.
    Die Erfolgsraten mit der nicht-chirurgischen Methode liegen bei frischen Embryonen je nach Arbeitsgruppe zwischen 30 % und maximal 60 %; hingegen können mit Hilfe der chirurgischen Methode Trächtigkeitsraten zwischen 70 % und 90 % erzielt werden. In Hasbergen haben wir uns aus diesem Grund als erste private Embryotransferstations Europas von vornherein für die chirurgische Methode entschieden. Nach Transfer der ersten vier frischen Embryonen waren drei Empfänger tragend, alle haben inzwischen lebende Fohlen zur Welt gebracht. In diesem Jahr haben ausschließlich mit tiefgefrorenen Embryonen gearbeitet und wiederum fünf Trächtigkeiten erzielen können. Nach unseren Erfahrungen mit dem chirurgischen Transfer wird dieser Eingriff sehr gut von den Stuten toleriert. Wir haben nach bislang 12 Transfers keinerlei postoperative Komplikationen beobachten können

    Zyklussynchronisation
    Zur erfolgreichen Durchführung des ETs ist neben der technischen Beherrschung von Gewinnung, Handhabung und Übertragung der Embryonen jedoch noch einiges Wesentliches mehr von Bedeutung. Zum ersten kommt hier die Zyklussynchronisation hinzu: Die Empfängerstute muß zum Zeitpunkt der Übertragung in etwa den gleichen Zyklusstand aufweisen wie die Spenderstute, sonst stirbt der Embryo nach der Übertragung ab. Genauer ausgedrückt: Die Empfängerstute darf höchstens 1 Tag vor der Spenderin ovuliert haben und höchstens 2 Tage nach ihr. Liegen die Eisprünge der beiden Stuten weiter auseinander, so sind ihre Zyklen nicht synchron und es kann kein erfolgreicher ET durchgeführt werden. In den Anfangszeiten des ET was es sehr schwierig, die Stuten zu synchronisieren. Damals hat man teilweise drei Empfängerstuten pro Spender vorbereitet, um zu gewährleisten, dass tatsächlich eine Stute synchron mit der Spenderin ovuliert hat. Heute sind unsere Möglichkeiten derart erweitert, dass in ca. 90 % der Fälle die Synchronisation mit nur einer Empfängerstute gelingt. Dies bedeutet einen wesentlich geringeren Aufwand. Überhaupt ist die Empfängertierhaltung ein ganz wesentlicher Kostenfaktor beim Embryotransfer. Insbesondere dann, wenn der ET mit Problemstuten versucht werden soll, bei denen möglicherweise nur in jeder dritten Spülung ein Embryo zu gewinnen ist. Wir haben daher nach Möglichkeiten gesucht, Embryonengewinnung und -übertragung voneinander organisatorisch zu trennen. Nur durch Tiefgefrierkonservierung der gewonnen Embryonen ist dies möglich, und zwar mit Erfolg.

    Tiefgefrorene Embryonen
    Unmittelbar nach der Spülung werden die Embryonen aus der Spülflüssigkeit unter einem Mikroskop isoliert, mehrfach gewaschen und schließlich in zwei Stuten mit einem Gefrierschutzmittel versehen, das - ähnlich wie bei den Samenzellen - eine Eiskristallbildung in den Zellen und damit ihre Zerstörung verhindern soll. Anschließend werden die Embryonen in Plastikröhrchen aufgezogen und diese mit einem Kunststoffstopfen verschlossen. Diese Röhrchen werden dann in ein vorgekühltes Alkoholbad gelegt, welches automatisch stufenweise bis auf -33 Grad C abgekühlt wird. Der gesamte Einfriervorgang dauert etwa zwei Stunden. Schließlich können die Pailletten direkt in flüssigen Stickstoff bei --196 Grad C eingelagert werden.
    Zum Auftauen werden die Röhrchen direkt in 25 Grad C warmes Wasser überführt und nach 15 Sekunden abgetrocknet und in Petrischälchen entleert. Der Embryo muß nun langsam von dem Gefrierschutzmittel befreit werden, da dieses schädlich ist. Geschieht dies zu schnell, platzt der Embryo. Die Wahl des geeigneten Gefrierschutzmittels sowie des optimalen Ausverdünnungsverfahrens scheint sehr maßgeblich für den Erfolg des ETs mit TG-Embryonen zu sein.

    Empfängerstuten
    Ebenso ausschlaggebend für den Erfolg des ETs ist die Qualität der Empfängerstuten. Nur absolut geschlechtsgesunde Stuten finden bei uns als Empfänger Verwendung. Wir haben in der zurückliegenden Saison acht tiefgefrorene aufgetaute Embryonen übertragen. Alle Embryonen waren rein äußerlich nach dem Auftauen intakt. Von insgesamt fünf tragenden Empfängern sind heute nach vier tragend und erwarten in wenigen Wochen bzw. Monaten ihre Fohlen (eine Stute resorbierte bedauerlicherweise in der vierten Trächtigkeitswoche).
    Der große Vorteil der Kryokonservierung von Embryonen besteht in der Möglichkeit, den Embryotransfer Schritt für Schritt anzugehen: erstens die Gewinnung und Einlagerung der Embryonen, zweitens die Beschaffung von Empfängern oder den Verkauf von Embryonen und drittens die Übertragung der Embryonen. Alles sofort auf einmal vorzubreiten bzw. zu organisieren erscheint für manchen Betreiber etwas viel Aufwand und Risiko zu beinhalten, insbesondere dann, wenn der Auftraggeber noch keine Erfahrung mit diesen Techniken hat sammeln können. Vor allem aber macht die Möglichkeit des Handels mit tiefgefrorenen Embryonen den ET für viele Interessenten überhaupt erst attraktiv.

    Theorie und Praxis
    Abschließend ein Bespiel für die praktische Machbarkeit von theoretisch kompliziert erscheinenden Vorhaben auf diesem Gebiet: Im April 95 erwarten wir ein ganz besonderes Fohlen. Es müsste eigentlich "Das zweifach Gefrorene" oder "Stickstofffreak" heißen. Denn die Mutter dieses Fohlen wurde mit einer einzigen Portion tiefgefrorenen Importsamens des amerikanischen Spitzenvollblutarabers Padrons Mahogany besamt. Sechs Tage später gewannen wir einen Embryo, welcher wiederum tiefgefroren wurde. Fünf Monate später wurde dieser Embryo aufgetaut und auf die Empfängerstute "Farrucca"übertragen. Weitere sechs Tage später konnten wir bereits mit Hilfe des Ultraschalls feststellen, das Farrucca tragend war. Sie ist es bis heute. Nun hoffen wir nur noch, dass sie ein gesundes Fohlen zur Welt bringt. Was wollen wir mehr?



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