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Re: chemische Sequenzierung von DNA
LarsderEisbaer - 23.09.2004, 20:47chemische Sequenzierung von DNA
Servus!
Ich verstehe die chemische Sequenzierung von DNA leider überhaupt nicht und da ich damit schon in der letzten Klausur auf die Nase gefallen bin, hoffe ich dass ich hier jemanden finde der mir weiterhelfen kann. Aus meiner Vorlesungsmitschrift werde ich nicht schlau und sonst hab ich nichts hilfreiches gefunden. Ist ja wohl auch etwas überholt das Verfahren.
Re: chemische Sequenzierung von DNA
integer - 23.09.2004, 21:18
jawohl- hilfe kommt bestimmt.
also- bei der chemischen sequenzierung macht man folgendes:
zunächst markiert man eine dna-probe 5`mit radioaktivem phosphat, dann sieht man sie nachher besser auf dem gel.
dann modifiziert man die basen. bei den purinen macht man das mit dms ( dimethylsulfoxid). dms methyliert nur A und G und nicht T unc C. wenn man die basen modifiziert hat, hat man die möglichkeit die basen von der ribose zu trennen. jetzt kommt ein wichtiger punkt: es kommt darauf an wie man die methylierte dna nach methylierung weiter behandelt. setzt man sie hitze bei einem pH von 7 aus, so wird vorwiegend die glycosidische Bindung bei guanosin gebrochen, behandelt man sie aber in schwach saurem medium so wird hauptsächlich die glyc. bindung bei adenosin gebrochen. aus dem bindungsbruch resultieren apurinstellen, die alkalilabil sind, und somit bei basenbehandlung zum strangbruch führen. bei einer elektrophorese kann man dann verschieden lange fragmente sehen ( die markierten stellen dann das 5`ende der kette dar). man kann somit herausfinden, wo sich in der dna bspw. ein G oder ein A befindet.
ähnlich verhält es sich mit den pyrimidinen. auch diese kann man spezifisch und abhängig von den äußeren bedingungen modifizieren.
als modifizierungsreagenz verwendet man hier Hydrazin. dieses modifiziert
in neutralem medium das thymin und führt eine apyrimidinstelle ein, die alkalilabil ist. wenn man jedoch mit hydrazin in 2M NaCl modifiziert wird bevorzugt C angegriffen und natürlich findet dann auch bevorzugt an C-Resten Strangbruch statt.
bei der ganzen methode steckt nun folgende idee dahinter:
man nimmt sich einen dna strang und behandelt ihn in vier unterschiedlichen reaktionsansätzen: einmal mit hydrazin in neutralem medium und spaltet basisch, dann in 2M NaCl und spaltet basisch. dann behandelt man in DMS bei neutralem pH und spaltet basisch und mit DMS in saurem medium und spaltet basisch.
es ist davon auszugehen, dass in jedem reaktionsansatz verschiedene fragmente entstehen, die aber alle jeweils nur einmal gespalten wurden. die ganzen ansätze trägt man dann auf ein PAA-Gel auf und läßt sie laufen.
anhand der entstehenden banden weiß man dann ganz genau die basenabfolgen. denn: die fragmente ganz links ( hier z.b. die spaltung bei A) haben an ihrem ende alleA gehabt. die fragmente in der laufbahn daneben ( könnte z.b die spaltung von G gewesen sein) haben alle ein G an der letzten Position gehabt. wenn die bande ganz links weiter gelaufen ist, als die daneben, dann kommt dasA eher in der sequenz als das G. nach diesem schema läßt sich also die basenabfolge von unten nach oben im gel ablesen.
:roll:
ich konnte jetzt hier nicht reinzeichnen und habe es bestmöglichst versucht zu erklären. hoffe geholfen zu haben, wenn dennoch was unklar ist. einfach nochmal posten ;-)
bis denndann
Re: chemische Sequenzierung von DNA
LarsderEisbaer - 24.09.2004, 17:26
Danke
:n178:
Re: chemische Sequenzierung von DNA
BryanBell - 24.09.2004, 17:37
Mann-o-meter! Dem ist nichts hinzuzufuegen! Wie waer's wenn du mal n Lehrbuch schreibst?! BC im Grundstudium oder so?! Wenn du's machen wuerdest und Hilfe brauchst bin ich auf jeden Fall dabei!:)
Re: chemische Sequenzierung von DNA
integer - 24.09.2004, 18:41
:shock: ups, eigentlich dachte ich, das wär jetzt ziemlich diffus gewesen da oben.
aber beim skript für die bc 3 wär hilfe bestimmt ganz cool ;-)
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